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Le virus devient viral : un kit pédagogique pour les classes de virologie - Méthodes

Index de l'article

Méthodes

Virus et cellules

Les virus TPV, CVG, PDV et Niemeyer (NYMV) ont été propagés individuellement en utilisant Acanthamoeba castellanii (American Type Culture Collection [ATCC] 30010) cultivé à 32 °C dans des flacons de culture cellulaire de 175 cm2 avec 50 ml d'extrait de levure peptonée avec du glucose (PYG) en milieu complété par 25 mg/ml d'amphotéricine B (Fungizone ; Cristalia, São Paulo, Brésil) et 500 U/ml de pénicilline (Schering-Plough, Brésil). Les amibes ont été infectées avec une multiplicité d'infection (MOI) de 0,01. Les cellules ont été incubées jusqu'à ce que les ECP attendus apparaissent en culture, et le milieu a été recueilli par deux étapes de centrifugation. Les cellules d'A. castellanii et les débris cellulaires ont d'abord été éliminés par centrifugation (400 x g pendant 10 min), et les particules ont été purifiées par centrifugation (36 000 x g pendant 1 h) à travers un coussin de saccharose (40-50%), mises en suspension dans le PAS, et stockées à - 80 °C. Le KAUV, l'OBRV et le FTSV ont été propagés individuellement dans le Vermamoeba vermiformis (ATCC50237) cultivé à 32 °C en milieu PYG avec un MOI de 0,01. Après l'apparition des ECP, les cellules et les surnageants ont été collectés, à l'aide de pipettes sérologiques stériles, stockés dans des tubes coniques stériles, et les virus ont été purifiés par ultracentrifugation avec un coussin de saccharose.

Les cellules BSC-40 (ATCC CRL-2761) et les cellules Vero (ATCC CCL-81) de rein de singe vert africain ont été maintenues dans une atmosphère contenant 5 % de CO2 à 37 °C dans le milieu essentiel minimum d'Eagle (MEM ; Gibco BRL, Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis), complétée par 5 % de sérum bovin fœtal (FBS ; Cultilab, Brésil), 2.5 μg/mL d'amphotéricine B, 500 U/mL de pénicilline (Cristalia), et 50 μg/mL de streptomycine (Schering-Plough, São Paulo, Brésil).

Le YFV (souche vaccinale 17DD), le MAYV (souche BeAr20290), le CHIKV (génotype ECSA - souche BHI3762/H804917, aimablement fourni par le Dr Maurício Lacerda Nogueira), le VACV groupe I (isolat de l'œil de Caragola I), le VACV groupe II (isolat de l'œil de Caragola II) et le CPXV (souche Brighton Red) ont été multipliés individuellement dans des cellules Vero du MEM qui en contenait 1-2.5 % de FBS, 0,25 μg/mL d'amphotéricine B, 100 U/mL de pénicilline 100 U/mL (Schering-Plough, Brésil), et 100 μg/mL de streptomycine à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % de CO2 dans une grande bouteille de 175 cm2. Par la suite, pour le YFV, le MAYV et le CHIKV, le surnageant d'infection cellulaire a été transféré dans des tubes et centrifugé à 3 000 x g pendant 5 min. Les surnageants clarifiés issus de ces centrifugations ont été stockés à - 70 °C. Le VACV et le CPXV ont été purifiés sur un gradient de saccharose comme décrit précédemment [25] et stockés à - 70 °C.

Préparation des lames pour la visualisation microscopique

Particules virales

Des aliquotes de virus purifiés ont été diluées au 1:10 (CVG, OBRV, PdV et TPV) ou au 1:20 (NYMV), et 10 μL de la dilution appropriée ont été placés au centre de la lame de verre. Le liquide a été étalé par des mouvements circulaires pour obtenir une goutte d'environ 1 cm de diamètre. La lame a été maintenue à température ambiante jusqu'à ce que le liquide sèche à la surface. Par la suite, le virus a été fixé en ajoutant 200 μL de méthanol au centre de la lame et coloré au cristal violet pendant 15 minutes. Après la coloration, les lames ont été lavées à l'eau courante et séchées à température ambiante. Une fois séchée, la région colorée a été recouverte d'une lamelle de verre de 13 mm et fixée sur la lame avec du baume du Canada (Synth, Brésil).

Usines à virus

Environ 1 million de cellules d'A. castellanii en milieu PYG ont été cultivées dans des flacons de culture cellulaire (25 cm2). Après que les amibes aient adhéré au flacon, le NYMV a été inoculé avec un MOI de 1. Après une infection de 12 heures, les cellules ont été retirées du flacon et centrifugées à 885 x g pendant 10 min et colorées avec des réactifs hémacolores (Renylab, Brésil). Une fois séchée, la région colorée a été recouverte d'une lamelle de verre de 13 mm à l'aide de baume du Canada.

Unités de formation de plaques

Deux lignées cellulaires ont été utilisées pour la visualisation des unités de formation de la plaque virale. Pour le MAYV, le CHIKV et le YFV, des cellules Vero (2 × 105 cellules/puits) ont été plaquées sur des lamelles stériles de 13 mm, cultivées en MEM avec 5% de FBS pendant 24 h, et maintenues à 37 °C dans une atmosphère à 5% de CO2. Le lendemain, les cellules ont été infectées par des virus et observées jusqu'à l'apparition de l'ECP caractéristique (plaques de lyse). Une fois les ECP détectés, les lamelles ont été fixées dans du formaldéhyde (3,7 % v/v) pendant 2 h et colorées en violet cristal. Après la coloration, les lamelles ont été lavées, séchées et fixées sur les lames de verre à l'aide de baume du Canada. Pour les virus des deux groupes VACV et CPXV, la visualisation des plaques de lyse a été effectuée en infectant des cellules BSC-40. La même procédure décrite ci-dessus a été suivie pour préparer cette lame.

Organismes d'inclusion

Les cellules BSC-40 (2 × 105 cellules/puits) ont été plaquées sur des lamelles stériles de 13 mm, cultivées en MEM avec 5% de FBS pendant 24 h, et maintenues à 37 °C dans une atmosphère contenant 5% de CO2. Les cellules ont été infectées par le CPXV (MOI : 10), et une fois les ECP détectés, les lamelles ont été fixées dans du formaldéhyde (3,7% v/v) pendant 2 h et colorées avec la solution riche en éosine du kit hémacolor pendant 10 min. Après la coloration, les lamelles ont été lavées, séchées et fixées sur des lames de verre à l'aide de baume du Canada.