Bien que les sciences médicales aient fait des progrès significatifs ces dernières années, les médecins sont encore déconcertés par certaines maladies et ils utilisent le séquençage du génome entier pour découvrir la racine du problème.

Le séquençage du génome entier est un processus qui détermine la séquence d'ADN d'un génome entier. Le séquençage du génome entier est une approche de force brute pour résoudre les problèmes lorsqu'il existe une base génétique au cœur d'une maladie. Plusieurs laboratoires proposent aujourd'hui des services de séquençage, d'analyse et d'interprétation de génomes entiers.

Par exemple, le séquençage de l'exome entier est une alternative moins coûteuse que le séquençage du génome entier. Dans le séquençage de l'exome, le médecin ne séquencera que les régions codantes de l'ADN, productrices d'exon. En 2010, les médecins ont utilisé le séquençage de l'exome entier pour sauver un jeune garçon dont les intestins présentaient de multiples abcès mystérieux. L'enfant a subi plusieurs opérations du côlon sans aucun soulagement. Enfin, ils ont effectué le séquençage de l'exome entier, qui a révélé un défaut dans une voie qui contrôle l'apoptose (mort cellulaire programmée). Les médecins ont eu recours à une greffe de moelle osseuse pour surmonter cette maladie génétique, ce qui a permis de guérir l'enfant. Il a été la première personne à recevoir un traitement efficace basé sur un diagnostic de séquençage de l'ensemble de l'exome. Aujourd'hui, le séquençage du génome humain est plus facilement accessible et les résultats sont disponibles dans les deux jours pour environ 900 euros.

Stratégies utilisées pour le séquençage des projets

La technique de séquençage de base utilisée dans tous les projets de séquençage modernes est la méthode de terminaison de chaîne (également connue sous le nom de méthode didésoxy), que Fred Sanger a mise au point dans les années 1970. La méthode de terminaison de chaîne implique la réplication de l'ADN d'une matrice simple brin en utilisant une amorce et un désoxynucléotide régulier (dNTP), qui est un monomère, ou une unité d'ADN unique. L'amorce et le dNTP se mélangent à une petite proportion de didésoxynucléotides marqués par fluorescence (ddNTP). Les ddNTP sont des monomères auxquels il manque un groupe hydroxyle (-OH) à l'endroit où un autre nucléotide s'attache généralement pour former une chaîne. Les scientifiques étiquettent chaque ddNTP avec une couleur différente de fluorophore. Chaque fois qu'un ddNTP s'incorpore dans le brin complémentaire en croissance, il met fin au processus de réplication de l'ADN, ce qui se traduit par de multiples brins courts d'ADN répliqué qui se terminent chacun à un point différent au cours de la réplication. Lorsque l'électrophorèse sur gel traite le mélange réactionnel après sa séparation en brins simples, les multiples brins d'ADN nouvellement répliqués forment une échelle en raison de leur taille différente. Comme les ddNTP sont marqués par fluorescence, chaque bande du gel reflète la taille du brin d'ADN et le ddNTP qui a mis fin à la réaction. Les différentes couleurs des ddNTP marqués au fluorophore aident à identifier le ddNTP incorporé à cet endroit. La lecture du gel sur la base de la couleur de chaque bande sur l'échelle produit la séquence du brin matrice.

Un désoxynucléotide est constitué d'un sucre désoxyribose, d'une base et de trois groupes phosphate. Le didésoxyribose est identique au désoxyribose, sauf que le groupe hydroxyle OH, en position 3 prime est remplacé par H. Un hydroxyle 3 prime est nécessaire pour l'allongement de la chaîne ADN, et la chaîne cesse donc de croître si un didésoxyribose au lieu d'un désoxyribose est incorporé dans la chaîne en croissance.

 

Un didésoxynucléotide a une structure similaire à celle d'un désoxynucléotide, mais il lui manque le groupe hydroxyle 3' (indiqué par l'encadré). Lorsqu'un didésoxynucléotide est incorporé dans un brin d'ADN, la synthèse de l'ADN s'arrête.

Cette figure illustre la méthode de terminaison de la chaîne didésoxy de Frederick Sanger. En utilisant des didésoxynucléotides, le fragment d'ADN peut se terminer à différents points. L'ADN se sépare en fonction de sa taille, et nous pouvons lire ces bandes en fonction de la taille des fragments.

Les premières stratégies : Séquencement des fusils de chasse et séquencement des fins par paires

Dans la méthode de séquençage du fusil de chasse, plusieurs copies de fragments d'ADN sont coupées au hasard en de nombreux morceaux plus petits (un peu comme ce qui arrive à une cartouche à balle ronde lorsqu'on tire avec un fusil de chasse). Tous les segments sont séquencés selon la méthode du séquençage en chaîne. Ensuite, avec l'aide d'un ordinateur de séquençage, les scientifiques peuvent analyser les fragments pour voir où leurs séquences se chevauchent. En faisant correspondre les séquences qui se chevauchent à l'extrémité de chaque fragment, les scientifiques peuvent reformer la séquence d'ADN entière. Une séquence plus grande qui est assemblée à partir de séquences plus courtes qui se chevauchent s'appelle un contig. Par analogie, considérez que quelqu'un possède quatre copies d'une photographie de paysage que vous n'avez jamais vue auparavant et ne sait rien de la façon dont elle doit apparaître. La personne déchire ensuite chaque photographie avec ses mains, de sorte que des morceaux de taille différente sont présents sur chaque copie. La personne mélange ensuite tous les morceaux et vous demande de reconstituer la photographie. Dans l'un des plus petits morceaux, vous voyez une montagne. Dans un morceau plus grand, vous voyez que la même montagne se trouve derrière un lac. Un troisième fragment ne montre que le lac, mais il révèle qu'il y a une cabane sur la rive du lac. Par conséquent, en regardant les informations qui se chevauchent dans ces trois fragments, vous savez que l'image contient une montagne derrière un lac qui a une cabane sur sa rive. C'est le principe qui sous-tend la reconstruction de séquences d'ADN entières à l'aide d'un séquençage au fusil de chasse.

A l'origine, le séquençage au fusil de chasse n'analysait qu'une extrémité de chaque fragment pour détecter les chevauchements. Cela était suffisant pour le séquençage de petits génomes. Cependant, le désir de séquencer des génomes plus grands, comme celui d'un humain, a conduit à développer le séquençage à double canon, ou séquençage par paire. Dans le séquençage par paires, les scientifiques analysent l'extrémité de chaque fragment pour détecter les chevauchements. Le séquençage par paires est donc plus lourd que le séquençage par fusil de chasse, mais il est plus facile de reconstituer la séquence car il y a plus d'informations disponibles.

Séquencement de la prochaine génération

Depuis 2005, les techniques de séquençage automatisées utilisées par les laboratoires sont regroupées sous l'appellation "séquençage de nouvelle génération", qui désigne un ensemble de techniques automatisées utilisées pour le séquençage rapide de l'ADN. Ces séquenceurs automatisés à faible coût peuvent générer des séquences de centaines de milliers ou de millions de courts fragments (25 à 500 paires de bases) en l'espace d'une journée. Ces séquenceurs utilisent un logiciel sophistiqué pour passer à travers le processus fastidieux de mise en ordre de tous les fragments.

Comparaison des séquences

Un alignement de séquence est un arrangement de protéines, d'ADN ou d'ARN. Les scientifiques l'utilisent pour identifier des régions similaires entre des types de cellules ou des espèces, ce qui peut indiquer une conservation de la fonction ou de la structure. Nous pouvons utiliser les alignements de séquences pour construire des arbres phylogénétiques. Le site web suivant utilise un logiciel appelé BLAST (outil de recherche d'alignement local de base).

Sous "Basic Blast", cliquez sur "Nucleotide Blast". Saisissez la séquence suivante dans la grande case "séquence d'interrogation" : ATTGCTTCGATTGCA. Sous la boîte, localisez le champ "Espèce" et tapez "humain" ou "Homo sapiens". Cliquez ensuite sur "BLAST" pour comparer la séquence saisie avec les séquences connues du génome humain. Le résultat est que cette séquence se trouve à plus d'une centaine d'endroits du génome humain. Faites défiler le graphique vers le bas avec les barres horizontales et vous verrez une courte description de chacune des occurrences correspondantes. Choisissez l'une des occurrences en haut de la liste et cliquez sur "Graphiques". Cela vous amènera à une page qui montre l'emplacement de la séquence dans l'ensemble du génome humain. Vous pouvez déplacer le curseur qui ressemble à un drapeau vert d'avant en arrière pour visualiser les séquences immédiatement autour du gène sélectionné. Vous pouvez ensuite revenir à la séquence sélectionnée en cliquant sur le bouton "ATG".

Utilisation des séquences du génome entier d'organismes modèles

Le biochimiste britannique et prix Nobel Fred Sanger a utilisé un virus bactérien, le bactériophage fx174 (5368 paires de bases), pour séquencer complètement le premier génome. D'autres scientifiques ont ensuite séquencé plusieurs autres génomes d'organites et de virus. Le biotechnologiste, biochimiste, généticien et homme d'affaires américain Craig Venter a séquencé la bactérie Haemophilus influenzae dans les années 1980. Environ 74 laboratoires différents ont collaboré au séquençage du génome de la levure Saccharomyces cerevisiae, qui a commencé en 1989 et s'est achevé en 1996, car il était 60 fois plus important que tout autre séquençage du génome. En 1997, les séquences du génome de deux organismes modèles importants étaient disponibles : la bactérie Escherichia coli K12 et la levure Saccharomyces cerevisiae. Nous connaissons maintenant les génomes d'autres organismes modèles, tels que la souris Mus musculus, la mouche des fruits Drosophila melanogaster, le nématode Caenorhabditis. elegans et l'homme Homo sapiens. Les chercheurs effectuent des recherches fondamentales approfondies sur des organismes modèles car ils peuvent appliquer les informations à des organismes génétiquement similaires. Un organisme modèle est une espèce que les chercheurs utilisent comme modèle pour comprendre les processus biologiques chez d'autres espèces que l'organisme modèle représente. Le séquençage de génomes entiers contribue aux efforts de recherche dans ces organismes modèles. L'annotation du génome est le processus qui permet d'associer des informations biologiques aux séquences de gènes. L'annotation des séquences de gènes facilite les expériences de base en biologie moléculaire, telles que la conception d'amorces PCR et de cibles ARN.

Utilisation des séquences du génome

Les puces à ADN sont des méthodes que les scientifiques utilisent pour détecter l'expression des gènes en analysant différents fragments d'ADN qui sont fixés sur une lame de verre ou une puce de silicium afin d'identifier les gènes et les séquences actives. Les puces à ADN permettent de découvrir près d'un million d'anomalies génotypiques, tandis que le séquençage du génome entier peut fournir des informations sur les six milliards de paires de bases du génome humain. Bien que l'étude des applications médicales du séquençage du génome soit intéressante, cette discipline s'attarde sur la fonction anormale des gènes. La connaissance de l'ensemble du génome permettra aux chercheurs de découvrir précocement les futures maladies et autres troubles génétiques. Cela permettra de prendre des décisions plus éclairées sur le mode de vie, les médicaments et la procréation. La génomique en est encore à ses débuts, même si un jour il pourrait devenir habituel d'utiliser le séquençage du génome entier pour dépister chaque nouveau-né afin de détecter les anomalies génétiques.

Outre les maladies et la médecine, la génomique peut contribuer à la mise au point de nouvelles enzymes qui convertissent la biomasse en biocarburant, ce qui se traduit par une augmentation de la production de cultures et de carburants, et par une baisse du coût pour le consommateur. Ces connaissances devraient permettre de meilleures méthodes de contrôle des microbes que l'industrie utilise pour produire des biocarburants. La génomique pourrait également améliorer les méthodes de surveillance qui mesurent l'impact des polluants sur les écosystèmes et aident à nettoyer les contaminants environnementaux. La génomique a contribué au développement de produits agrochimiques et pharmaceutiques qui pourraient profiter à la science médicale et à l'agriculture.

Il semble formidable de disposer de toutes les connaissances que nous pouvons tirer du séquençage du génome entier ; cependant, les humains ont la responsabilité d'utiliser ces connaissances à bon escient. Sinon, il pourrait être facile d'abuser du pouvoir de ces connaissances, ce qui conduirait à une discrimination fondée sur la génétique d'une personne, le génie génétique humain et d'autres préoccupations éthiques. Ces informations pourraient également entraîner des problèmes juridiques concernant la santé et la vie privée.

D'après Whole-Genome Sequencing

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