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Hsp70 expression membranaire sur des biopsies de tumeurs de SCCHN patients

Les biopsies tumorales ont été obtenu à partir de patients avec SCCHN par résection de la tumeur (n = 21) et de référence tissus conjonctifs de donneurs sans tumeur (n = 7). L'état de la membrane Hsp70 (mHsp70) viables a été déterminée sur des suspensions de cellules isolées par cytométrie de flux (FACS) de l'analyse à l'aide de l'anticorps monoclonal cmHsp70.1. Le pourcentage moyen de cellules positives pour Hsp70 était significativement plus élevée chez les patients atteints de tumeurs par rapport à celle du tissu de 7 tissus témoins qui ont été préparées en parallèle (moyenne de 38% contre 13%) (Figure 1A). Le pourcentage de cellules positives dans les biopsies de patients mHsp70 varie entre 5 et 100%. En fonction de leur état de Hsp70 membrane, les résultats des échantillons de patients peuvent être répartis en deux sous-groupes. Le pourcentage moyen de cellules positives mHsp70 dans le groupe avec une forte expression de Hsp70 (n = 11) était d'environ 83% et celle du bas Hsp70 groupe exprimant (n = 1) était de 20% (figure 1A, boîtes à moustaches sur la main droite côté). Les valeurs d'intensité de fluorescence moyenne en corrélation avec les données de pourcentage de cellules positives pour Hsp70 membranaires (figure 1B).

Figure 1. Hsp70 expression membranaire sur des biopsies de patients SCCHN.A.Les cellules colorées avec FITC-anticorps marqué cmHsp70.1 monoclonal corrigé avec un anticorps de contrôle IgG1 isotype sont représentés dans les diagrammes en boîte. Les données provenant des cellules tumorales des patients (n = 21) ont été divisées en (n = 11) des cellules exprimant de faibles (n = 10) et mHsp70 élevées. Les cellules individuelles provenant de donneurs sains (n = 7) provenant de tissus conjonctifs ont été utilisés comme témoins. B.L'intensité de fluorescence de pied comme indiqué dans A. standard diagrammes en boîte les mêmes données sont représentées avec frontières indiquant la 25moyenne.e et le 75e centile  La ligne à l'intérieur des boîtes indique la médiane et les moustaches indiquent les 10e et 90e percentile, respectivement. Toutes les valeurs aberrantes sont incluses dans les graphiques. (*P<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).

Taux sériques sHsp70 chez les patients avec SCCHN

Pour répondre à la question de savoir si la Hsp70 expression membranaire en corrélation avec les Hsp70 (sHsp70) des taux sériques solubles, les niveaux étaient sHsp70 déterminé dans le sérum des patients SCCHN avant le début de tout traitement. Les niveaux sHsp70 moyennes étaient significativement élevés chez les patients atteints de SCCHN (5,3 ± 4,1 ng / ml, n = 21) par rapport à des volontaires sains d'âge correspondant (2,2 ± 0,6 ng / ml, n = 28) (Figure 2A).des patients atteints de tumeurs qui présentent une membrane haute Hsp70 (mHsp70) expression (Figure 1,Les taux sériques haut) présentaient également plus élevés sHsp70 (7,2 ± 6,7 ng / ml, n = 11) que chez les patients avec un faible (Figure 1,bas) membrane Hsp70 expression (3,4 ± 1,2 ng / ml, n = 10) (figure 2B).

Figure 2. taux sériques sHsp70 dans le sang des patients atteints de SCCHN.Une.Concentrations sHsp70 dans le sérum des patients (n = 21) avant traitement par rapport aux donneurs sains (n = 28). B.données de sérum sHsp70 de patients ont été séparés en deux groupes (haute n = 11, bas n = 10) reflétant l'expression membranaire mHsp70 mesurée en A. C.boîtes à moustaches standard sont présentés avec des limites indiquant la 25e et le 75e centile. La ligne à l'intérieur des boîtes indique la médiane et les moustaches indiquent les 10e et 90epercentile, respectivement. Toutes les valeurs aberrantes sont présentés. (***P<0,001) C.La courbe ROC de données à partir de (A) ont été atteints par le logiciel SigmaPlot montrant une ASC de 0,9101(p<0,0001, IC à 95%). Le niveau de coupure est de 2,5 ng / ml avec une sensibilité de 89% et une spécificité de 91%). Abr .: ROC, récepteur caractéristique de fonctionnement; ASC, l'aire sous la courbe; CI, intervalle de confiance.

 

Récepteur analyse (ROC) de la courbe caractéristique de fonctionnement a été effectuée afin d'étudier le rôle potentiel de sHsp70 dans le sérum comme un biomarqueur de diagnostic pour la tumeur SCCHN. Les niveaux sHsp70 de donneurs sains ont été comparées à celles de patients SCCHN. La courbe ROC révèle une aire sous la courbe (AUC) de 0,91 (p <0,0001, IC à 95%). Cela signifie que le niveau de coupure est de 2,5 ng / ml avec une sensibilité de 89% et avec une spécificité de 91% pour sHsp70 en tant que biomarqueur de tumeur.

Modifications dépendantes du temps en sHsp70 et anti-Hsp70 taux d'anticorps dans le sérum de SCCHNpatients

Un biomarqueurde tumeur idéal doit être capable de prédire les réponses cliniques au traitement, tels que la radiothérapie ou la chirurgie. Hsp70 niveaux solubles ont été trouvés pour être élevée de façon significative chez les patients avant le traitement de tumeurs (5,3 ± 4,1 ng / ml, n = 21) par rapport à des donneurs sains (2,2 ± 0,6 ng / ml, n = 28). Les niveaux est restée élevée jusqu'à 6 semaines après la résection de la tumeur (7,0 ± 3,6 ng / ml, n = 10) (figure 3,au cours de la thérapie). Dans la première et la deuxième année de suivi après radiothérapie niveaux sHsp70 chuté à 3,4 ± 1,4 ng / ml (n = 9) et de 3,1 ± 1,1 ng / ml (n = 14), respectivement (figure 3,suivi 1ère année, suivi 2e année) .Le signifie concentrations d'anticorps anti-Hsp70 n'étaient pas significativement différents chez les patients de tumeur avant le traitement (122 ± 119 ng / ml, n = 16) et chez des volontaires humains sains (84 ± 64 ng / ml), comme représenté sur la figure 4.De plus, après le traitement (chirurgie / radiothérapie) les concentrations moyennes d'anticorps anti-Hsp70 dans le sérum n'ont pas changé de manière significative (140 ± 119 ng / ml, n = 6).

Figure 3. sHsp70 niveaux dans le sérum des patients non traités SCCHN et après le traitement. sang ont été recueillis à partir de patients atteints de SCCHN. sHsp70 concentration a été mesurée par ELISA dans trois expériences indépendantes en double. Boîtes à moustaches standard sont présentés avec des limites indiquant la 25e et le 75e centile. La ligne à l'intérieur des boîtes indique la médiane et les moustaches indiquent les 10e et 90epercentile, respectivement. Toutes les valeurs extrêmes sont indiquées dans le graphique. (Santé n = 28, avant le traitement n = 21, pendant le traitement n = 10, suivi 1ère année n = 9, suivi2deème année n = 14). La raison pour laquelle les différents numéros de n est due à des échantillons de sang manquantes au cours de l'évolution de la maladie. (*P<0,05, ***p<0,001).

Figure 4. Anti-Hsp70 Les taux d'anticorps dans le sérum de patients avant et à points de temps indiqués après la radiothérapie.Cours Durée d'anticorps anti-Hsp70 dans le sérum de patients atteints de tumeurs SCCHN avant et après la thérapie. Le sang a été recueilli et les anticorps anti-Hsp70 ont été déterminées par l'anticorps anti-Hsp70 ELISA. Boîtes à moustaches standard sont présentés avec des limites indiquant la 25e et le 75e centile. La ligne à l'intérieur des boîtes indique la médiane et les moustaches indiquent les 10e et 90e percentile, respectivement. Toutes les valeurs extrêmes sont indiquées dans le graphique. (En bonne santé n = 4, les patients avant le traitement n = 16 patients ayant subi un traitement au moins 6 semaines après la radiothérapie n = 6).

Corrélation de protéine sHsp70 et anti-Hsp70 taux d'anticorps avec le volume de la tumeur de patients atteints de SCCHN

Pour évaluer si les taux d'anticorps ou de protéines sHsp70 sérum anti-Hsp70 en corrélation avec le volume de la tumeur, les volumes tumoraux ont été déterminés en utilisant des images CT. La taille de la tumeur dans la cohorte de patients de SCCHN (n = 13) avant la radiothérapie se situait au-dessous de 10 ml à 40 ml (> la taille maximale de la tumeur était de 65 ml). Bien que non statistiquement significative, les niveaux de sHsp70 sériques décelés chez les patients avec des volumes de tumeurs plus grandes sont plus élevées que chez les patients atteints de tumeurs plus petits (R2= 0,6427) (Figure 5A), tandis que les taux d'anticorps anti-Hsp70 dans le sérum n'ont pas montré d'association avec le volume de la tumeur(R2= 0,1198) (Figure 5B).

Figure 5. Corrélation entre le volume de la tumeur avec la protéine Hsp70 et-Hsp70 de lutte contre des taux sériques d'anticorps chez les patients avecSCCHN. des volumes tumorauxOnt été déterminées par une courbe de niveau manuellement le volume de la tumeur brut (GTV) de patients en fonction de contraste amélioré ordinateur tomographie balayages avant la radiothérapie. Les volumes tumoraux ont été évalués en ml associés à la sérum sHsp70(A,n = 13) et de l'anticorps anti-Hsp70(B,n = 10) niveaux comme déterminé par ELISA. La régression linéaire a été déterminée par SigmaPlot logiciel statistique.

Expression des activateurs des récepteurs de cellules NK sur les PBL de patients SCCHN

Afin de vérifier la pertinence de l'sHsp70 en ce qui concerne la stimulation d'une réponse immunitaire des cellules NK médiée par l'expression d'activateurs des marqueurs de cellules NK était évalué dans les échantillons de sang de patients sélectionnés avant l'excision de la tumeur et à des temps plus tardifs indiqués après la radiothérapie. La densité de l'expression des marqueurs CD56, CD94, NKp30, NKp44, NKp46 et varié chez les patients testés avant, pendant le traitement et pendant la période de suivi (Figure 6AF). En ce qui concerne le récepteur NKG2D, la densité de l'expression augmentée progressivement tout au long de la période de surveillance de l'ensemble de tous les patients (figure 6C). Une augmentation significative de la densité de l'expression de NKG2D a été observée dans le sang des patients avant le traitement (1) et après la deuxième année de suivi (4) (figure 6G, n = 7).

Figure 6. Cellules NK marqueurs activateurs sur les lymphocytes du sang périphérique (PBL) de SCCHN patients avant et à des périodes indiquées après le traitement. Échantillons de sang EDTA chez certains patients (n = 7) ont été recueillis à des moments indiqués avant la thérapie (1), après résection de la tumeur avant le début du traitement d'irradiation (2), dans la1ère année de suivi (3), et dans la 2ème année de suivi (4). Les points de temps de chirurgie et la radiothérapie sont indiqués par S et R, dans la partie supérieure de chaque graphique. Les cellules NK ont été colorées en utilisant le procédé de lyse-lavage et analysées par cytométrie en flux. AF.CD56-positif et les cellules CD3-négatifs NK ont été bloqués et analysés. L'intensité de fluorescence (MFI) de CD56, CD94, NKG2D, NKp30, NKp44 signifie, NKp46 ont été déterminés. Temps courbes sont présentés pour chaque patient. G.Les valeurs moyennes d'intensité de fluorescence de tous les marqueurs de tous les patients avec des barres d'erreur et l'écart type (n = 7). Échantillons ont été prélevés avant le traitement (1), après résection de la tumeur avant le début de la radiothérapie (2), en 1ère année de suivi (3), et en 2ème année de suivi (4) * p <0,05.

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