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Patients et méthodes

Patients

Au total, 21 (20 hommes, 1 femme) patients souffrant de tumeurs localisées dans la cavité buccale (5 cas), du larynx (6), oro / hypopharynx (2), de l'oropharynx (7), des sinus (1) et 28 appariés selon l'âge des volontaires sains ont été inclus dans l'étude (tableaux 1 et 2). L'âge moyen des patients était de 66,7 ans (extrêmes: 38-78) avec une médiane de 66,0 années et que des personnes en bonne santé était de 61,0 (moyenne 47-74) avec une moyenne de 61,5 ans, respectivement (tableau 1). Les caractéristiques clinico-pathologiques et du régime de chaque patient individuel de traitement sont résumés dans le tableau 2.Le volume des tumeurs a été déterminé par les contours manuellement le volume tumoral macroscopique (GTV) sur la base de contraste amélioré scans tomographiques en utilisant un logiciel de planification iPlan (Brainlab, Feldkirchen, Allemagne). Nombre de doses de rayonnement suivants excision de la tumeur était de 64 Gy (11 patients), et 60 Gy (2 patients), respectivement. Un patient a reçu une irradiation définitive avec une dose totale de 70 Gy et 7 patients n'a reçu aucune radiothérapie adjuvante après résection complète de la tumeur. Tous les patients et les individus sains ont donné par écrit leur consentement éclairé pour la collecte du sang et des biopsies tumorales qui a été approuvé par le Comité d'éthique de la Klinikum rechts der Isar der Technische Universität München. Le sang a été recueilli à partir de patients porteurs de tumeurs non traités avant la chirurgie et une radiothérapie et à des points temporels indiqués après l'excision de la tumeur et de la radiothérapie par ponction veineuse. 9 ml d'EDTA-sang et 9 ml de sérum ont été recueillis dans S-Monovettes (Sarstedt, Nümbrecht, Allemagne).

Tableau 1

Age et sexe des patients SCCHN et des volontaires en bonne santé
  Healthy controls SCCHN patients
Number (n) 28 21
Gender (M/F) 12/16 20/1
Age Mean (Range) 61.0 (47–74) 66.7 (38–78)
  SD 7.0 9.2
  Median 61.5 66.0

AbbreviationsM male, F female, SD standard deviation, SCCHN Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck.

Gehrmann et al.

Gehrmann et al. Radiation Oncology 2014 9:131   doi:10.1186/1748-717X-9-131

Tableau 1. L'âge et le sexe des patients SCCHN et des volontaires sains

Tableau 2

Clinicopathological characteristics of all SCCHN patients
Patient # Tumor location Stadium Grading Therapy
T N M Surgery RTx dose (Gy)
1 Oral cavity 2 2 cd 0 2 + 0
2 Larynx 4 2b 0 3 + 64
3 Oral Cavity 1 0 0 2 + 60
4 Oro/Hypopharynx 4 2a 0 2 + 64
5 Oropharynx 3 2 0 2 - 70
6 Oropharynx 1 2b 0 3 + 64
7 Oral Cavity 1 2a 0 2 + 64
8 Oro/Hypopharynx 1 0 0 2 + 64
9 Oral Cavity 1 0 0 2 + 64
10 Oral Cavity 1 0 0 3 + 0
11 Oropharynx 2 2a 0 2 + 0
12 Larynx 2 2b 0 3 + 0
13 Oropharynx 4 0 0 2 + 64
14 Oropharynx 2 0 0 3 + 64
15 Larynx 3 0 0 3 + 64
16 Larynx 4 1 0 3 + 0
17 Oropharynx 2 2b 0 3 + 0
18 Oropharynx 2 1 0 2 + 64
19 Larynx 2 1 0 2 + 64
20 Sinus 2 0 0 3 + 60
21 Larynx 4 0 0 3 + 0

Gehrmann et al.

Gehrmann et al. Radiation Oncology 2014 9:131   doi:10.1186/1748-717X-9-131

Tableau 2. Caractéristiques clinico-pathologiques de tous les patients atteints de SCCHN

Biopsies de tumeurs

Des biopsies de l’orde de quelques mm3 ont été prélevées au cours de l'excision de la tumeur. A titre de référence, les tissus conjonctifs dérivés de 7 donneurs sans tumeur ont été recueillies. Des suspensions de cellules uniques à partir de biopsies de tumeurs fraîchement isolées ont été isolés par désintégration mécanique et en forçant la suspension de cellules à travers un tamis stérile (75 pm) pour obtenir des suspensions de cellules isolées selon un procédé décrit précédemment[14].

Sérum

Le sang a été centrifugé à 750 x g à la température ambiante (RT) pendant 10 min, le surnageant contenant le sérum a été retiré, mélangé, et conservé à -80 ° C en aliquotes. Les sérums ont été utilisés pour des expériences après décongélation qu'une seule fois. des échantillons de sérum de contrôle ont été recueillies chez des volontaires humains sains appariés selon l'âge (tableau 1).

tests ELISA

niveaux totale sHsp70 dans des échantillons de sérum de l'homme ont été mesurés en utilisant un dosage immunologique Hsp70 modifié (Duoset, DYC1663, R & D Systems, Minneapolis, MN, USA). Le test ELISA est conçu pour détecter Hsp70 humain dans un tampon. Tous les échantillons de sérum ont été analysés dans trois expériences indépendantes en double.

Anticorps anti-Hsp70 dans le sérum ont été détectés en utilisant un ELISA en sandwich. En bref, la protéine Hsp70 (ADI-NSP-555, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA) a été appliqué sur des plaques à 96 puits MaxiSorp (NuncNalgene, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Après incubation avec le sérum les anticorps liés ont été détectés par incubation avec Ig HRP-anti-humain conjugué suivie par HRP-substrat (DY999, R & D Systems, Minneapolis, MN, USA).

Cytométrie en flux

des cellules simples de biopsies tumorales fraîchement isolés ont été préparés par des procédés mécaniques désagrégation du tissu, comme décrit précédemment [14].1 × 105 cellules ont été lavées une fois avec 10% de FCS dans du PBS et incubées avec un anticorps monoclonal de souris conjugué à FITC spécifique de Hsp70 lié à la membrane (cmHsp70.1, IgG1, multimmune GmbH, Munich, Allemagne) ou un isotype marqué au FITC IgG1 -matched anticorps de contrôle négatif (345815, BD Biosciences, Franklin Lakes, New Jersey, Etats-Unis) sur la glace dans l'obscurité pendant 30 min. Après lavage, l'iodure de propidium a été ajouté et les cellules viables ont été analysés sur un cytomètre de flux FACSCalibur (BD Biosciences). Le pourcentage de cellules colorées avec un anticorps de contrôle correspondant à l'isotype a été soustrait du pourcentage de cellules positives mHsp70.

Marqueurs de cellules NK ont été déterminés dans le sang périphérique des patients par cytométrie en flux comme décrit précédemment [15]. Après incubation avec des anticorps de fluorescence conjugué (CD56, CD94, CD3, CD94, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46), ou des anticorps témoins d'isotype de souris appropriée, des erythrocytes ont été lysés en utilisant le FACS solution de lyse (BD Biosciences) selon le fabricant instructions. Après lavage, les lymphocytes ont été analysés sur un cytomètre de flux FACSCalibur (BD Biosciences). Les cellules NK ont été bloqués en fonction de leur positivité de CD56 et CD3 négativité. Le pourcentage de cellules colorées avec un anticorps de contrôle isotype a été soustrait du pourcentage de cellules colorées anticorps positive.

Analyse statistique

L'analyse statistiquea été réalisée en utilisant le logiciel SigmaPlot délivré par Systat Software Inc. (San Jose, CA, USA). Résultats pour les niveaux d'anticorps mHsp70, sHsp70, ou des anti-Hsp70 sont présentés comme des boîtes à moustaches standards avec des limites indiquant la 25e et le 75e centile. La ligne à l'intérieur des boîtes indique la médiane et les moustaches indiquent les 10e et 90e percentile, respectivement. Toutes les valeurs aberrantes sont présentés. Le carré du coefficient de paramètre de corrélation R2 et l'analyse de régression linéaire ont été utilisés pour déterminer les relations entre les variables. A titre de comparaison entre groupes de donnéesde l'étudiant tla -testa été utilisé pour évaluer les différences. P-values <0,05 était considérée comme statistiquement significative.

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