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Les biomarqueurs sont de plus en plus importants pour un meilleur pronostic et pour l'amélioration et le suivi d'une thérapie comme montré récemment pour les tumeurs gastro-intestinales [1,2].Les Biomarqueurs optimaux doivent être présents à la surface cellulaire d'une large variété de cellules tumorales, mais pas sur les cellules normales et doivent être libérés d'une manière spécifique par une tumeur. Afin d'utiliser des biomarqueurs pour la prédiction de résultat, il est important que les biomarqueurs restent stables au cours de l'intervention thérapeutique. La présence de biomarqueurs dans l'urine ou le sang d'un patient permet des tests répétés avec une intervention invasive minimale .

 

Pendant longtemps, les protéines de choc thermique dont l’Hsp70 et les auto-anticorps dirigés contre eux se sont avérés fournir des biomarqueurs utiles pour la prédiction du cancer de la prostate [3] et le carcinome spinocellulaire de l'œsophage[4]. Des niveaux de protéine de choc thermique élevés ont été détectés dans de nombreux types de cancer[5]. Néanmoins, les approches n'ont pas été suffisamment validées et ne sont donc pas encore en usage clinique. Le Hsp70 principal membre de la famille HSP70 inductible par le stress a le potentiel pour être un marqueur molléculaire prédictif pour plusieurs raisons. Le Hsp70 est surexprimé dans de nombreux types de tumeurs ; il protège les cellules contre les dommages de l'ADN [6], et exerce des fonctions anti-apoptotiques[7].  Surexprimée dans les cellules, la Hsp70 est transportée à la membrane cellulaire et également exportés dans l'espace extracellulaire[8]. Les voies de transport ne suivent pas les voies de transport classiques à travers l'appareil de Golgi et le RE mais sont médiés par des vésicules endosomiales et lysosomiales[9]. Seule une petite proportion de Hsp70  est libérée sous forme Hsp70 libre par la mort cellulaire nécrotique. Nos résultats démontrent que la majorité du Hsp70 extracellulaire est lié à de petites vésicules lipidiques[9]. Ces vésicules sont activement libérés par les cellules tumorales sans doute à des fins de signalisation. Il a déjà été montré que le Hsp70 libéré peut stimuler le système immunitaire adaptatif [10]. Les cellules NK reconnaissent également Hsp70, s’y lient et peuvent donc être activées [11]. Après l'activation, les cellules NK migrent activement à des cellules tumorales positives pour Hsp70, et les tue par l'intermédiaire de la libération de l'enzyme cytotoxique granzyme B [12].

L’Hsp70 extracellulaires peut être détecté par ELISA. Les résultats récents de notre exposition de groupe montrent que Hsp70 peut être détecté dans le plasma des souris portant des xénogreffes de tumeurs humaines [13]. En outre, les taux plasmatiques de Hsp70 sont en corrélation avec la charge tumorale des souris en supposant le potentiel de Hsp70 en tant que marqueur tumoral prédictif.

Comme Hsp70 peut être libéré par des cellules tumorales humaines avec un phénotypeune de membrane Hsp70-positif , nous avons étudié l'impact du diagnostic de sHsp70 dans le sérum de patients souffrant de SCCHN. Les taux sériques de sHsp70 ont été évalués chez des patients avant et à différents moments après la radiothérapie et comparées à celles de témoins en bonne santé. Afin d'étudier le rôle de sHsp70 comme un stimulateur potentiel des cellules NK Nous avons étudié de manière concomitante l'expression de marqueurs activateurs des cellules NK sur les PBL de patients.


Patients et méthodes

Patients

Au total, 21 (20 hommes, 1 femme) patients souffrant de tumeurs localisées dans la cavité buccale (5 cas), du larynx (6), oro / hypopharynx (2), de l'oropharynx (7), des sinus (1) et 28 appariés selon l'âge des volontaires sains ont été inclus dans l'étude (tableaux 1 et 2). L'âge moyen des patients était de 66,7 ans (extrêmes: 38-78) avec une médiane de 66,0 années et que des personnes en bonne santé était de 61,0 (moyenne 47-74) avec une moyenne de 61,5 ans, respectivement (tableau 1). Les caractéristiques clinico-pathologiques et du régime de chaque patient individuel de traitement sont résumés dans le tableau 2.Le volume des tumeurs a été déterminé par les contours manuellement le volume tumoral macroscopique (GTV) sur la base de contraste amélioré scans tomographiques en utilisant un logiciel de planification iPlan (Brainlab, Feldkirchen, Allemagne). Nombre de doses de rayonnement suivants excision de la tumeur était de 64 Gy (11 patients), et 60 Gy (2 patients), respectivement. Un patient a reçu une irradiation définitive avec une dose totale de 70 Gy et 7 patients n'a reçu aucune radiothérapie adjuvante après résection complète de la tumeur. Tous les patients et les individus sains ont donné par écrit leur consentement éclairé pour la collecte du sang et des biopsies tumorales qui a été approuvé par le Comité d'éthique de la Klinikum rechts der Isar der Technische Universität München. Le sang a été recueilli à partir de patients porteurs de tumeurs non traités avant la chirurgie et une radiothérapie et à des points temporels indiqués après l'excision de la tumeur et de la radiothérapie par ponction veineuse. 9 ml d'EDTA-sang et 9 ml de sérum ont été recueillis dans S-Monovettes (Sarstedt, Nümbrecht, Allemagne).

Tableau 1

Age et sexe des patients SCCHN et des volontaires en bonne santé
  Healthy controls SCCHN patients
Number (n) 28 21
Gender (M/F) 12/16 20/1
Age Mean (Range) 61.0 (47–74) 66.7 (38–78)
  SD 7.0 9.2
  Median 61.5 66.0

AbbreviationsM male, F female, SD standard deviation, SCCHN Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck.

Gehrmann et al.

Gehrmann et al. Radiation Oncology 2014 9:131   doi:10.1186/1748-717X-9-131

Tableau 1. L'âge et le sexe des patients SCCHN et des volontaires sains

Tableau 2

Clinicopathological characteristics of all SCCHN patients
Patient # Tumor location Stadium Grading Therapy
T N M Surgery RTx dose (Gy)
1 Oral cavity 2 2 cd 0 2 + 0
2 Larynx 4 2b 0 3 + 64
3 Oral Cavity 1 0 0 2 + 60
4 Oro/Hypopharynx 4 2a 0 2 + 64
5 Oropharynx 3 2 0 2 - 70
6 Oropharynx 1 2b 0 3 + 64
7 Oral Cavity 1 2a 0 2 + 64
8 Oro/Hypopharynx 1 0 0 2 + 64
9 Oral Cavity 1 0 0 2 + 64
10 Oral Cavity 1 0 0 3 + 0
11 Oropharynx 2 2a 0 2 + 0
12 Larynx 2 2b 0 3 + 0
13 Oropharynx 4 0 0 2 + 64
14 Oropharynx 2 0 0 3 + 64
15 Larynx 3 0 0 3 + 64
16 Larynx 4 1 0 3 + 0
17 Oropharynx 2 2b 0 3 + 0
18 Oropharynx 2 1 0 2 + 64
19 Larynx 2 1 0 2 + 64
20 Sinus 2 0 0 3 + 60
21 Larynx 4 0 0 3 + 0

Gehrmann et al.

Gehrmann et al. Radiation Oncology 2014 9:131   doi:10.1186/1748-717X-9-131

Tableau 2. Caractéristiques clinico-pathologiques de tous les patients atteints de SCCHN

Biopsies de tumeurs

Des biopsies de l’orde de quelques mm3 ont été prélevées au cours de l'excision de la tumeur. A titre de référence, les tissus conjonctifs dérivés de 7 donneurs sans tumeur ont été recueillies. Des suspensions de cellules uniques à partir de biopsies de tumeurs fraîchement isolées ont été isolés par désintégration mécanique et en forçant la suspension de cellules à travers un tamis stérile (75 pm) pour obtenir des suspensions de cellules isolées selon un procédé décrit précédemment[14].

Sérum

Le sang a été centrifugé à 750 x g à la température ambiante (RT) pendant 10 min, le surnageant contenant le sérum a été retiré, mélangé, et conservé à -80 ° C en aliquotes. Les sérums ont été utilisés pour des expériences après décongélation qu'une seule fois. des échantillons de sérum de contrôle ont été recueillies chez des volontaires humains sains appariés selon l'âge (tableau 1).

tests ELISA

niveaux totale sHsp70 dans des échantillons de sérum de l'homme ont été mesurés en utilisant un dosage immunologique Hsp70 modifié (Duoset, DYC1663, R & D Systems, Minneapolis, MN, USA). Le test ELISA est conçu pour détecter Hsp70 humain dans un tampon. Tous les échantillons de sérum ont été analysés dans trois expériences indépendantes en double.

Anticorps anti-Hsp70 dans le sérum ont été détectés en utilisant un ELISA en sandwich. En bref, la protéine Hsp70 (ADI-NSP-555, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA) a été appliqué sur des plaques à 96 puits MaxiSorp (NuncNalgene, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Après incubation avec le sérum les anticorps liés ont été détectés par incubation avec Ig HRP-anti-humain conjugué suivie par HRP-substrat (DY999, R & D Systems, Minneapolis, MN, USA).

Cytométrie en flux

des cellules simples de biopsies tumorales fraîchement isolés ont été préparés par des procédés mécaniques désagrégation du tissu, comme décrit précédemment [14].1 × 105 cellules ont été lavées une fois avec 10% de FCS dans du PBS et incubées avec un anticorps monoclonal de souris conjugué à FITC spécifique de Hsp70 lié à la membrane (cmHsp70.1, IgG1, multimmune GmbH, Munich, Allemagne) ou un isotype marqué au FITC IgG1 -matched anticorps de contrôle négatif (345815, BD Biosciences, Franklin Lakes, New Jersey, Etats-Unis) sur la glace dans l'obscurité pendant 30 min. Après lavage, l'iodure de propidium a été ajouté et les cellules viables ont été analysés sur un cytomètre de flux FACSCalibur (BD Biosciences). Le pourcentage de cellules colorées avec un anticorps de contrôle correspondant à l'isotype a été soustrait du pourcentage de cellules positives mHsp70.

Marqueurs de cellules NK ont été déterminés dans le sang périphérique des patients par cytométrie en flux comme décrit précédemment [15]. Après incubation avec des anticorps de fluorescence conjugué (CD56, CD94, CD3, CD94, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46), ou des anticorps témoins d'isotype de souris appropriée, des erythrocytes ont été lysés en utilisant le FACS solution de lyse (BD Biosciences) selon le fabricant instructions. Après lavage, les lymphocytes ont été analysés sur un cytomètre de flux FACSCalibur (BD Biosciences). Les cellules NK ont été bloqués en fonction de leur positivité de CD56 et CD3 négativité. Le pourcentage de cellules colorées avec un anticorps de contrôle isotype a été soustrait du pourcentage de cellules colorées anticorps positive.

Analyse statistique

L'analyse statistiquea été réalisée en utilisant le logiciel SigmaPlot délivré par Systat Software Inc. (San Jose, CA, USA). Résultats pour les niveaux d'anticorps mHsp70, sHsp70, ou des anti-Hsp70 sont présentés comme des boîtes à moustaches standards avec des limites indiquant la 25e et le 75e centile. La ligne à l'intérieur des boîtes indique la médiane et les moustaches indiquent les 10e et 90e percentile, respectivement. Toutes les valeurs aberrantes sont présentés. Le carré du coefficient de paramètre de corrélation R2 et l'analyse de régression linéaire ont été utilisés pour déterminer les relations entre les variables. A titre de comparaison entre groupes de donnéesde l'étudiant tla -testa été utilisé pour évaluer les différences. P-values <0,05 était considérée comme statistiquement significative.


Résultats

Hsp70 expression membranaire sur des biopsies de tumeurs de SCCHN patients

Les biopsies tumorales ont été obtenu à partir de patients avec SCCHN par résection de la tumeur (n = 21) et de référence tissus conjonctifs de donneurs sans tumeur (n = 7). L'état de la membrane Hsp70 (mHsp70) viables a été déterminée sur des suspensions de cellules isolées par cytométrie de flux (FACS) de l'analyse à l'aide de l'anticorps monoclonal cmHsp70.1. Le pourcentage moyen de cellules positives pour Hsp70 était significativement plus élevée chez les patients atteints de tumeurs par rapport à celle du tissu de 7 tissus témoins qui ont été préparées en parallèle (moyenne de 38% contre 13%) (Figure 1A). Le pourcentage de cellules positives dans les biopsies de patients mHsp70 varie entre 5 et 100%. En fonction de leur état de Hsp70 membrane, les résultats des échantillons de patients peuvent être répartis en deux sous-groupes. Le pourcentage moyen de cellules positives mHsp70 dans le groupe avec une forte expression de Hsp70 (n = 11) était d'environ 83% et celle du bas Hsp70 groupe exprimant (n = 1) était de 20% (figure 1A, boîtes à moustaches sur la main droite côté). Les valeurs d'intensité de fluorescence moyenne en corrélation avec les données de pourcentage de cellules positives pour Hsp70 membranaires (figure 1B).

Figure 1. Hsp70 expression membranaire sur des biopsies de patients SCCHN.A.Les cellules colorées avec FITC-anticorps marqué cmHsp70.1 monoclonal corrigé avec un anticorps de contrôle IgG1 isotype sont représentés dans les diagrammes en boîte. Les données provenant des cellules tumorales des patients (n = 21) ont été divisées en (n = 11) des cellules exprimant de faibles (n = 10) et mHsp70 élevées. Les cellules individuelles provenant de donneurs sains (n = 7) provenant de tissus conjonctifs ont été utilisés comme témoins. B.L'intensité de fluorescence de pied comme indiqué dans A. standard diagrammes en boîte les mêmes données sont représentées avec frontières indiquant la 25moyenne.e et le 75e centile  La ligne à l'intérieur des boîtes indique la médiane et les moustaches indiquent les 10e et 90e percentile, respectivement. Toutes les valeurs aberrantes sont incluses dans les graphiques. (*P<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).

Taux sériques sHsp70 chez les patients avec SCCHN

Pour répondre à la question de savoir si la Hsp70 expression membranaire en corrélation avec les Hsp70 (sHsp70) des taux sériques solubles, les niveaux étaient sHsp70 déterminé dans le sérum des patients SCCHN avant le début de tout traitement. Les niveaux sHsp70 moyennes étaient significativement élevés chez les patients atteints de SCCHN (5,3 ± 4,1 ng / ml, n = 21) par rapport à des volontaires sains d'âge correspondant (2,2 ± 0,6 ng / ml, n = 28) (Figure 2A).des patients atteints de tumeurs qui présentent une membrane haute Hsp70 (mHsp70) expression (Figure 1,Les taux sériques haut) présentaient également plus élevés sHsp70 (7,2 ± 6,7 ng / ml, n = 11) que chez les patients avec un faible (Figure 1,bas) membrane Hsp70 expression (3,4 ± 1,2 ng / ml, n = 10) (figure 2B).

Figure 2. taux sériques sHsp70 dans le sang des patients atteints de SCCHN.Une.Concentrations sHsp70 dans le sérum des patients (n = 21) avant traitement par rapport aux donneurs sains (n = 28). B.données de sérum sHsp70 de patients ont été séparés en deux groupes (haute n = 11, bas n = 10) reflétant l'expression membranaire mHsp70 mesurée en A. C.boîtes à moustaches standard sont présentés avec des limites indiquant la 25e et le 75e centile. La ligne à l'intérieur des boîtes indique la médiane et les moustaches indiquent les 10e et 90epercentile, respectivement. Toutes les valeurs aberrantes sont présentés. (***P<0,001) C.La courbe ROC de données à partir de (A) ont été atteints par le logiciel SigmaPlot montrant une ASC de 0,9101(p<0,0001, IC à 95%). Le niveau de coupure est de 2,5 ng / ml avec une sensibilité de 89% et une spécificité de 91%). Abr .: ROC, récepteur caractéristique de fonctionnement; ASC, l'aire sous la courbe; CI, intervalle de confiance.

 

Récepteur analyse (ROC) de la courbe caractéristique de fonctionnement a été effectuée afin d'étudier le rôle potentiel de sHsp70 dans le sérum comme un biomarqueur de diagnostic pour la tumeur SCCHN. Les niveaux sHsp70 de donneurs sains ont été comparées à celles de patients SCCHN. La courbe ROC révèle une aire sous la courbe (AUC) de 0,91 (p <0,0001, IC à 95%). Cela signifie que le niveau de coupure est de 2,5 ng / ml avec une sensibilité de 89% et avec une spécificité de 91% pour sHsp70 en tant que biomarqueur de tumeur.

Modifications dépendantes du temps en sHsp70 et anti-Hsp70 taux d'anticorps dans le sérum de SCCHNpatients

Un biomarqueurde tumeur idéal doit être capable de prédire les réponses cliniques au traitement, tels que la radiothérapie ou la chirurgie. Hsp70 niveaux solubles ont été trouvés pour être élevée de façon significative chez les patients avant le traitement de tumeurs (5,3 ± 4,1 ng / ml, n = 21) par rapport à des donneurs sains (2,2 ± 0,6 ng / ml, n = 28). Les niveaux est restée élevée jusqu'à 6 semaines après la résection de la tumeur (7,0 ± 3,6 ng / ml, n = 10) (figure 3,au cours de la thérapie). Dans la première et la deuxième année de suivi après radiothérapie niveaux sHsp70 chuté à 3,4 ± 1,4 ng / ml (n = 9) et de 3,1 ± 1,1 ng / ml (n = 14), respectivement (figure 3,suivi 1ère année, suivi 2e année) .Le signifie concentrations d'anticorps anti-Hsp70 n'étaient pas significativement différents chez les patients de tumeur avant le traitement (122 ± 119 ng / ml, n = 16) et chez des volontaires humains sains (84 ± 64 ng / ml), comme représenté sur la figure 4.De plus, après le traitement (chirurgie / radiothérapie) les concentrations moyennes d'anticorps anti-Hsp70 dans le sérum n'ont pas changé de manière significative (140 ± 119 ng / ml, n = 6).

Figure 3. sHsp70 niveaux dans le sérum des patients non traités SCCHN et après le traitement. sang ont été recueillis à partir de patients atteints de SCCHN. sHsp70 concentration a été mesurée par ELISA dans trois expériences indépendantes en double. Boîtes à moustaches standard sont présentés avec des limites indiquant la 25e et le 75e centile. La ligne à l'intérieur des boîtes indique la médiane et les moustaches indiquent les 10e et 90epercentile, respectivement. Toutes les valeurs extrêmes sont indiquées dans le graphique. (Santé n = 28, avant le traitement n = 21, pendant le traitement n = 10, suivi 1ère année n = 9, suivi2deème année n = 14). La raison pour laquelle les différents numéros de n est due à des échantillons de sang manquantes au cours de l'évolution de la maladie. (*P<0,05, ***p<0,001).

Figure 4. Anti-Hsp70 Les taux d'anticorps dans le sérum de patients avant et à points de temps indiqués après la radiothérapie.Cours Durée d'anticorps anti-Hsp70 dans le sérum de patients atteints de tumeurs SCCHN avant et après la thérapie. Le sang a été recueilli et les anticorps anti-Hsp70 ont été déterminées par l'anticorps anti-Hsp70 ELISA. Boîtes à moustaches standard sont présentés avec des limites indiquant la 25e et le 75e centile. La ligne à l'intérieur des boîtes indique la médiane et les moustaches indiquent les 10e et 90e percentile, respectivement. Toutes les valeurs extrêmes sont indiquées dans le graphique. (En bonne santé n = 4, les patients avant le traitement n = 16 patients ayant subi un traitement au moins 6 semaines après la radiothérapie n = 6).

Corrélation de protéine sHsp70 et anti-Hsp70 taux d'anticorps avec le volume de la tumeur de patients atteints de SCCHN

Pour évaluer si les taux d'anticorps ou de protéines sHsp70 sérum anti-Hsp70 en corrélation avec le volume de la tumeur, les volumes tumoraux ont été déterminés en utilisant des images CT. La taille de la tumeur dans la cohorte de patients de SCCHN (n = 13) avant la radiothérapie se situait au-dessous de 10 ml à 40 ml (> la taille maximale de la tumeur était de 65 ml). Bien que non statistiquement significative, les niveaux de sHsp70 sériques décelés chez les patients avec des volumes de tumeurs plus grandes sont plus élevées que chez les patients atteints de tumeurs plus petits (R2= 0,6427) (Figure 5A), tandis que les taux d'anticorps anti-Hsp70 dans le sérum n'ont pas montré d'association avec le volume de la tumeur(R2= 0,1198) (Figure 5B).

Figure 5. Corrélation entre le volume de la tumeur avec la protéine Hsp70 et-Hsp70 de lutte contre des taux sériques d'anticorps chez les patients avecSCCHN. des volumes tumorauxOnt été déterminées par une courbe de niveau manuellement le volume de la tumeur brut (GTV) de patients en fonction de contraste amélioré ordinateur tomographie balayages avant la radiothérapie. Les volumes tumoraux ont été évalués en ml associés à la sérum sHsp70(A,n = 13) et de l'anticorps anti-Hsp70(B,n = 10) niveaux comme déterminé par ELISA. La régression linéaire a été déterminée par SigmaPlot logiciel statistique.

Expression des activateurs des récepteurs de cellules NK sur les PBL de patients SCCHN

Afin de vérifier la pertinence de l'sHsp70 en ce qui concerne la stimulation d'une réponse immunitaire des cellules NK médiée par l'expression d'activateurs des marqueurs de cellules NK était évalué dans les échantillons de sang de patients sélectionnés avant l'excision de la tumeur et à des temps plus tardifs indiqués après la radiothérapie. La densité de l'expression des marqueurs CD56, CD94, NKp30, NKp44, NKp46 et varié chez les patients testés avant, pendant le traitement et pendant la période de suivi (Figure 6AF). En ce qui concerne le récepteur NKG2D, la densité de l'expression augmentée progressivement tout au long de la période de surveillance de l'ensemble de tous les patients (figure 6C). Une augmentation significative de la densité de l'expression de NKG2D a été observée dans le sang des patients avant le traitement (1) et après la deuxième année de suivi (4) (figure 6G, n = 7).

Figure 6. Cellules NK marqueurs activateurs sur les lymphocytes du sang périphérique (PBL) de SCCHN patients avant et à des périodes indiquées après le traitement. Échantillons de sang EDTA chez certains patients (n = 7) ont été recueillis à des moments indiqués avant la thérapie (1), après résection de la tumeur avant le début du traitement d'irradiation (2), dans la1ère année de suivi (3), et dans la 2ème année de suivi (4). Les points de temps de chirurgie et la radiothérapie sont indiqués par S et R, dans la partie supérieure de chaque graphique. Les cellules NK ont été colorées en utilisant le procédé de lyse-lavage et analysées par cytométrie en flux. AF.CD56-positif et les cellules CD3-négatifs NK ont été bloqués et analysés. L'intensité de fluorescence (MFI) de CD56, CD94, NKG2D, NKp30, NKp44 signifie, NKp46 ont été déterminés. Temps courbes sont présentés pour chaque patient. G.Les valeurs moyennes d'intensité de fluorescence de tous les marqueurs de tous les patients avec des barres d'erreur et l'écart type (n = 7). Échantillons ont été prélevés avant le traitement (1), après résection de la tumeur avant le début de la radiothérapie (2), en 1ère année de suivi (3), et en 2ème année de suivi (4) * p <0,05.


Discussion

Les biomarqueurs tumoraux sont des outils utiles pour la détection de la tumeur et de suivi de l'évolution clinique. Au lieu de biopsies tumorales, qui sont difficiles à obtenir, des échantillons de sang qui peuvent être prises régulièrement par des méthodes peu invasives qualifient beaucoup mieux mesurer les résultats cliniques. protéines de choc thermique sont souvent surexprimés dans les cellules tumorales et par conséquent sont rapportés en tant que biomarqueurs [5],dans la prostate [3], et dans les cancers du pancréas[16]. Il a également été démontré précédemment que les niveaux élevés Hsp70 peuvent agir comme une lecture de l'efficacité de thérapies Hsp90 [17] repose-inhibiteur.Aussi auto-anticorps dirigés contre Hsp70 dans le carcinome épidermoïde [4] sont discutés en tant que biomarqueurs potentiels.

Comme déjà démontré pour d'autres entités tumorales [14] tumeurs également VADS sont souvent jugés Hsp70 membrane positif (Figure 1). En outre, dans notre relativement petite cohorte de 21 patients deux sous-groupes peuvent être identifiés qui diffèrent dans leur membrane positivité Hsp70. Onze patients ont montré une haute et dix patients une expression membranaire faible Hsp70. Un suivi plus long des patients et l'essai d'une cohorte plus importante de patients permettra de mieux comprendre si les différences dans la membrane densité Hsp70 a un impact sur le diagnostic ou le résultat clinique. En outre, nous avons pu montrer que l'expression de Hsp70 sur la membrane biopsie tumorale est associée à des taux sériques accrus sHsp70 (figure 2). Niveaux sHsp70 élevée étaient détectables jusqu'à six semaines après la résection de la tumeur (Figure 3).Une légère augmentation des taux sériques sHsp70 pourrait s'expliquer par sHsp70 qui sont rejetées par les cellules mourantes pendant le traitement. Pendant la période de suivi première et deuxième année, les niveaux sHsp70 chuté de façon significative chez les patients qui n'ont pas rechuté. Contrairement à la protéine sHsp70 les niveaux d'anticorps anti-Hsp70 ont été seulement légèrement augmenté chez les patients atteints de tumeurs par rapport à celle de sujets en bonne santé.

Nous avons pu montrer que, dans un modèle de xénogreffe de souris de tumeur FaDu bien établie de SCCHN, les concentrations sHsp70 humains en corrélation avec la volume de la tumeur, même dans de très petites tailles de tumeur demm ≈ 13[13].Par conséquent, nous pensons que les niveaux sHsp70 pourraient être utiles dans des tests de dépistage visant à détecter le cancer à un stade précoce ou dans de petites tumeurs ou métastases aussi chez les humains. Le modèle de xénogreffe FaDu est fréquemment utilisé pour étudier les résultats de la radiothérapie[18]. Nous avons pu montrer que les niveaux de plasma sHsp70 étaient en mesure de surveiller le contrôle local des tumeurs FaDu chez la souris après irradiation avec 30 Gy[13]. Par conséquent, une baisse des taux sériques sHsp70 pourrait être en mesure de prédire l'issue clinique de la radiothérapie chez l'homme.

Il a été montré que Hsp70 est activement libéré par les cellules tumorales viables intactes, et également à un niveau inférieur par les cellules mourantes[13]. Ainsi, les sHsp70 détectables dans le sérum ou le plasma peuvent être composés de deux sources différentes. D'autres laboratoires rapportés sur l'augmentation des niveaux de circulation sHsp70 jusqu'à plusieurs jours après l'irradiation de tout le corps des souris portant des xénogreffes de tumeurs de la prostate[19] qui peut être expliqué par les cellules mourantes. La légère augmentation des niveaux sHsp70 après la radiothérapie pourrait expliquer sHsp70 qui sont rejetées par les cellules mourantes. Mis à part les cellules qui meurent cellules tumorales viables sécrètent activement de grandes quantités de Hsp70 dans des vésicules. Afin d'évaluer la quantité sHsp70, des échantillons de sérum ont été obtenus de patients avec SCCHN avant le début de tout traitement. 18 des 21 patients atteints de tumeurs a montré des niveaux significativement élevés de sHsp70 dans le sérum par rapport à des sujets témoins sains (Figure 1).On pourrait en outre montrer que les taux d'anticorps sHsp70 protéine mais pas anti-Hsp70 pourrait être associée avec le volume de la tumeur chez les patients atteints de SCCHN (Figure 5A). Une analyse plus poussée et des études plus larges avec plus de patients montreront si les réponses de diagnostic ou cliniques ne sont en corrélation avec les niveaux sHsp70 [20].

La densité de l'expression des marqueurs activateurs des cellules NK qui pourraient être affectées par la présence de la protéine sHsp70 dans le sérum a été déterminée dans le sang périphérique Les lymphocytes de patients atteints de SCCHN avant, pendant et après la thérapie. Dans des études récentes nous avons pu montrer que, en particulier la densité d'expression de CD94 et NKG2D ont été trouvés à être régulés à la hausse lors de la stimulation avec la protéine Hsp70 [21]. Ici, nous avons pu montrer que chez tous les patients présentant sHsp70 l'expression de NKG2D a été significative, se retrouve à être régulée à la hausse au fil du temps (Figure 6G). Analyse avenir préciser si les niveaux sHsp70 avant traitement ou des changements de niveaux sHsp70 qui sont induits par la thérapie pourrait être responsable de l'augmentation de l'expression de NKG2D sur les cellules NK.

En résumé, nos données montrent que des niveaux élevés de protéines sHsp70 dans le sang de la tumeur patients sont associées à la présence de tumeurs primaires malignes chez les patients atteints de SCCHN. Par ailleurs, l'augmentation des niveaux sHsp70 ont été trouvés pour être associée à une augmentation des volumes des tumeurs. Puisque les niveaux sHsp70 diminué chez les patients après le retrait de la tumeur, nous pensons que les niveaux sHsp70 dans le sang des patients pourraient être utiles non seulement pour la détection de tumeurs, mais également pour la surveillance de la réponse thérapeutique à une thérapie par rayonnement. En raison de la constatation que mHsp70 est associée à la capacité des cellules tumorales à libérer activement Hsp70 et en raison du fait que mHsp70 positivité a été déterminée sur une large variété d'entités tumorales telles que colorectal, du poumon, du pancréas et le cancer de la prostate [16,22-24],nous supposons que sHsp70 est également présent dans le sérum de patients atteints d'autres entités tumorales. Les futures études sur des cohortes plus importantes et de plus longues périodes de suivi sont nécessaires pour déterminer le rôle des niveaux sHsp70 comme un biomarqueur de la tumeur universel.


Intérêts concurrents

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun conflit d'intérêts.


Les contributions des auteurs

MG ont effectué des expériences et le manuscrit rédigé, HS recueillies des échantillons de sang et ont fourni des données cliniques, CB ont effectué des expériences ELISA, MB a recueilli des échantillons de tumeurs, des échantillons de tumeurs de la Colombie-Britannique recueillies, MD a recueilli des échantillons de sang, SB a effectué une analyse FACS, KH effectuée ELISA, SL effectuée ELISA, VVP a analysé les données, ES a prélevé des échantillons de sang, TES analysé les données, MS effectuée prélevé des échantillons de sang, DS a analysé les données, WS a effectué une analyse FACS, SS a effectué une analyse FACS, GM a lancé le procès, a analysé les données, rédigé le Mme Tous les auteurs lu et approuvé le manuscrit final.


Remerciements

Les auteurs remercient Jessica Pelzel et Andrea Mair pour une excellente assistance technique et Henning Bier et Julia Hiller pour fournir des échantillons de patients de la tumeur. Cette étude a été soutenue en pièces par le DFG - Pôle d'excellence: Munich-Centre for Advanced Photonics, le ministère fédéral allemand de l'Éducation et de la Recherche (BMBF, 0313909), le m4 - Pôle d'excellence: la médecine personnalisée (BMBF, 16EX1021C, 16GW0030 ), la SFB824 / B4 (DFG), le BMBF Kompetenzverbund Strahlenforschung (03NUK007E), UE-CELLEUROPE (315 963), Wilhelm Sander-Stiftung (2012.078.1) et par la Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München (KKF: 15 06). Eva Sage est soutenu par le programme de doctorat intitulée «Translationale médecine" qui est fournie par la Technische Universität München, Munich, AllemagneCR:.


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Auteurs

Mathias Gehrmann, Hanno M Specht, Christine Bayer, Markus Brandstetter, Barbara Chizzali, Marciana Douma, Stephanie Breuninger, Kathrin Hube, Sophie Lehnerer, Valerie van Phi, Eva Sage, Thomas Schmid E, Michael Sedelmayr, Daniela Schilling, Wolfgang Sievert, Stefan Stangl et Gabriele Multhoff*

  • Correspondant auteur: Gabriele Multhoff Cette adresse e-mail est protégée contre les robots spammeurs. Vous devez activer le JavaScript pour la visualiser.

Affiliations des auteurs

1. Département de radio-oncologie, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, Munich, Allemagne

2. Hals-Nasen-Ohrenklinik und Poliklinik, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München , Munich, Allemagne

3. Clinique Groupe de coopération - «l'immunité innée en biologie de la tumeur", Helmholtz Zentrum München, Munich, Allemagne

Cet article est une traduction de "Hsp70 - a biomarker for tumor detection and monitoring of outcome of radiation therapy in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck" sous licence CCA.

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